CARMEN, el nuevo y potente CRISPR que sirve como herramienta de diagnóstico

A estas alturas casi todos los que os interesáis por la ciencia habéis oído hablar de la tecnología CRISPR. Esta herramienta genética surgió como tal en el año 2012 y desde entonces se ha consolidado como una de las grandes promesas de la biología molecular. Cada año aparecen novedades en torno a ella.

Pues bien, en 2020 tenemos un paso más allá aún. Nuevamente han sido investigadores del Instituto Broad los que han publicado en Nature este nuevo avance. Vamos a ver en qué consiste la novedad.

¿QUÉ NOVEDAD HAN IDEADO?

Los investigadores han creado una herramienta que permite la detección simultánea de cientos de virus distintos en un número determinado de muestras clínicas. Pero este método también permite la detección de un solo virus en más de mil muestras clínicas. Al método lo han llamado CARMEN, acrónimo de Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids.

¿CÓMO LO HAN HECHO?

Para lograr esto, han combinado dos herramientas. Por un lado, SHERLOCK, de la que ya os hablamos en 2018 en este post, y, por otro, los dispositivos microfluídicos.

Os recordamos brevemente que SHERLOCK, acrónimo de Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing, es una herramienta derivada de CRISPR que se utiliza como técnica de diagnóstico. Si recordáis cuando os explicamos la tecnología CRISPR por primera vez, os explicamos que los sistemas CRISPR utilizan unas proteínas llamadas Cas que cortan el ADN en zonas específicas, concretas. Para llegar a esas zonas, para colocarse en esa parte concreta del ADN, Cas es guiada por una pequeña molécula de ARN que es complementaria a la zona del ADN donde va a actuar la proteína Cas. Al principio, la proteína Cas utilizada era Cas 9, pero posteriormente se han utilizado otras proteínas de la misma familia. Así, hay proteínas Cas, como la Cas13a, que son capaces de cortar moléculas de ARN, en vez de ADN. Los investigadores del Instituto Broad se dieron cuenta de que esta Cas13a tenía un “pequeño” problema.  Una vez que se encontraba con la secuencia específica de ARN que tenía que cortar, no solo cortaba esta secuencia específica, sino cualquier ARN al azar. Es decir, primero cortaba la secuencia específica y después el resto del ARN. Obviamente, esto la invalidaba para la edición genética. Pero estos mismos investigadores convirtieron una debilidad en una oportunidad. A partir de este “error” o efecto no deseado, desarrollaron una potente herramienta de diagnóstico.

Imaginemos una muestra clínica que puede contener un virus. Extraemos el ARN de esa muestra y lo mezclamos con otras pequeñas moléculas de ARN a las que hemos añadido compuestos que son fluorescentes, pero que solo emiten luz cuando se separan del ARN, es decir, cuando éste es cortado. Después añadimos el sistema CRISPR Cas13a. Es decir, ponemos la CAS13a guiada por un ARN que le lleva a buscar y cortar una secuencia específica del virus que queremos detectar. Si ese ARN no está, Cas13a no va a encontrarlo y no va a cortar nada. Recordemos que solo corta ARN al azar si primero ha cortado la secuencia específica. Al no cortar nada, no habrá fluorescencia, no habrá luz. Por lo tanto, la muestra es negativa.  Por el contrario, si encuentra la secuencia y la corta, después empezará a cortar los ARN unidos a las moléculas fluorescentes que nosotros hemos añadido y así se detectará la luz: la muestra es positiva.

Los dispositivos microfluídicos son aquellos que usan cantidades muy pequeñas de líquido en un microprocesador. Estos dispositivos ya se están usando como mecanismos de diagnóstico, puesto que al emplear nanogotas, las cantidades necesarias, tanto de muestras como de reactivos, son pequeñísimas. En este caso, los investigadores del Instituto Broad han empleado un dispositivo desarrollado originalmente en 2018 por el laboratorio de Paul Blainey para el descubrimiento de nuevos fármacos.

Imagen del dispositivo microfluídico original. Tomado de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6042083/

Como se puede entender de la imagen, se trata de un chip de silicona en el que se han practicado decenas de miles de pocillos, agujeritos minúsculos en los que solo caben dos nanogotas y que serían como los tubos de ensayo en los que se lleva a cabo la reacción.

¿CÓMO FUNCIONA?

En primer lugar, se generan dos nanogotas:

1. Nanogota de la muestra a analizar.
2. Nanogota donde van los reactivos. Es decir, aquí van disueltos Cas13, los ARN que guían a Cas13, y todo lo necesario para que se dé la reacción.

El siguiente paso es mezclar una nanogota de cada tipo y depositarlas en los pocillos que hemos comentado más arriba. Las muestras se unen entonces mediante una descarga eléctrica y eso inicia la reacción de manera simultánea en las decenas de miles de pocillos del chip. Surgirá entonces (si corresponde) la fluorescencia que será detectada por un microscopio de fluorescencia e interpretada por un ordenador.

Tenemos que darnos cuenta de que podemos analizar más de mil muestras frente a un virus o hasta 169 virus diferentes en un número más pequeño de muestras (cinco). Esto quiere decir que cuando anteriormente hemos hablado de nanogotas donde van los reactivos no nos referimos a una única solución a partir de la cual se hacen las nanogotas, sino que habrá tantos tipos de nanogotas de reactivos como virus queramos detectar (hasta 169 tipos diferentes), cada una con una codificación de colores fluorescentes diferente. Y lo mismo pasa con las muestras.

Cada prueba lleva sus replicados y controles, para asegurar la robustez estadística y asegurar que los resultados son fiables.

Imagen tomada del artículo original (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8)

¿PARA QUÉ VALE?

Pues CARMEN-Cas-13 se puede utilizar de dos maneras:

1. Como sistema de diagnóstico para detectar un virus de manera simultánea en más de mil muestras. Este sistema microfluídico puede detectar cualquier virus de uno de los 169 de los que hay publicados al menos diez genomas. Entre ellos, el SARS-CoV-2. Es decir, nos vale como una prueba bastante masiva de diagnóstico y puede ser utilizada para detectar la presencia de un patógeno en una situación de epidemia.
2. También se puede emplear como un panel “pan-viral”, de tal manera que, ante una duda clínica sobre la infección de un paciente, se puede comprobar qué virus es el que realmente está presente en la muestra. De hecho, han creado ya un panel respiratorio que incluye no solo el SAR-CoV-2, sino otros virus que provocan infecciones respiratorias, para que los médicos puedan discriminar perfectamente la causa infecciosa de los síntomas de los pacientes y establecer un diagnóstico diferencial.

Las aplicaciones en la detección son numerosas. Así, por ejemplo, se ha desarrollado un panel para detectar docenas de mutaciones en el VIH que le hacen resistente a los fármacos. Obviamente, esto es una gran ayuda para determinar el tratamiento más apropiado para cada paciente.

Todo esto se realiza en un dispositivo que es solo un poco más grande que un smartphone. El protocolo completo, incluyendo la extracción del ARN, llevó algo menos de ocho horas, aunque ya están trabajando para lograr acortar este tiempo. Y, además, esta nueva tecnología disminuye sustancialmente el coste de cada prueba, como podéis ver en la tabla. De utilizar Sherlock en una placa normal, con un coste de 5,52$ por prueba, a entre 0,05 y 0,42$ por muestra en el dispositivo microfluídico.

Imagen tomada del artículo original (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8)

 

En definitiva, estamos ante un importante avance más relacionado con CRISPR, en este caso de utilidad para el diagnóstico.